Nội dung chính của "Chị trợ lý của anh" xoay quanh câu chuyện giữa một cô gái thông minh giỏi việc Khả Doanh (do Mỹ Tâm thủ vai) và chàng doanh nhân trẻ tuổi Phúc Nam (Mai Tài Phến). Vì muốn cứu doanh nghiệp sữa của gia đình thoát khỏi sự thâu tóm của một tập đoàn nước ngoài, cô đành tạm rời bỏ chức vụ phó tổng giám đốc trong công ty mình để trở thành trợ lý cho Phúc Nam - giám đốc một công ty cà phê cùng với nhiệm vụ phải tìm cho anh ta một cô bạn gái. Trên hành trình đầy thử thách này, Doanh vô tình tìm thấy tình yêu đích thực của đời mình...